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中华人民共和国卫生行业标准登革热诊断标准及处理原则2
作者:zhangshengqi 点击数:1047更新时间:2008-7-21 0:00:00
A4.3.5  用pH7.2~7.4PBS 稀释荧光抗体,使其内含2个工作单位和1:8000伊文斯兰的荧光抗体, 加入各孔中,使完全覆盖抗原面,置湿盒中,37℃水浴作用30min,取出,如A4.3.4洗涤及吹干。
A4.3.6  用封片胶(或甘油缓冲液)封片,荧光显微镜观察结果。
A4.4  结果判断
特异性荧光呈黄绿色颗粒,分布在感染细胞浆中。根据荧光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比例可将荧光反应大致区分为"+~++++",无荧光者为"一"。检测抗体滴度时,以特异荧光达"++"最高血清稀释度的倒数表示。
A4.5  意义
阳性结果,表明提供血清的个体曾受到DV感染,大于1:80有诊断参考意义。恢复期抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或以上升高则可确诊。
A5  免疫斑点(dengue blot)试验检测 DV-IgG抗体
A5.1  原理
根据抗原抗体特异性结合的原理,把抗原固定于硝酸纤维素膜载体,与待测血清的特异性抗体结合成抗原抗体复合物,再与酶标记物结合,通过酶与底物作用产生颜色,表示阳性,阴性不显色。
A5.2  材料及方法
   (略)。
A5.5  意义
    阳性结果可作为DV感染参考。早期血清"一",恢复期血清"+"确诊DV感染。
A6  中和试验(NT)
A6.1  原理
使用对病毒敏感的动物、细胞或鸡胚为材料,测定病毒受免疫血清中和残存感染力与对照试验组比较,计算出中和指数。
A6.2  材料和方法
   (略)
A6.3  意义
    中和指数在9以下为阴性,10~49为可疑,50以上为阳性。用于鉴定病毒和疾病诊断。
 
B
( 提示的附录 )
登革热病原学检测
B1  应用单克隆抗体免疫荧光法(mbAb-IFA)检测DV抗原
B1.1  原理
感染DV的蚊虫体内,携带有DV抗原,可用DV单克隆抗体免疫荧光法检出蚊体内的特异性抗原。
B1.2  材料
多孔载玻片、10~100μL可调加样器、染色钵、试管、pH7.2PBS D1~D4型单克隆抗体、羊抗鼠IgG、丙酮等。
B1.3  检测步骤(间接法)
B1.3.1  蚊虫标本制备:待蚊虫胃内容物消化后,置-40℃冻死,用解剖刀去翅、肢,将头部和躯体分别放于载玻片圈内,盖上一块与之相对应的玻片,轻轻加压,使蚊组织最大限度地附在玻片上,小心分开两玻片,用镊子去除大片的骨骼,吹干,冷丙酮固定10min。
B1.3.2  用PBS轻轻洗一次,再用蒸馏水洗一次,吹干。
B1.3.3  加DF单克隆抗体,覆盖蚊组织,置于湿盒中,37℃水浴30min。
B1.3.4  取出,用PBS洗2次,蒸馏水洗1次,吹干。
B1.3.5  加羊抗鼠IgG,如B1.3.3、B1.3.4,孵育,洗涤。
B1.3.6  封片胶封片,荧光镜检。如单抗已荧光标记则免去B1.3.5,即为直接法。
B1.4  结果判断
用荧光显微镜观察,检出组织细胞胞质内有特异性黄绿色荧光,判为阳性,阴性无荧光
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